织糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)检测试剂盒
主要用途
组织糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取可溶性糖胺多糖,与二甲基亚甲基蓝染料结合,在丙醇解离溶液中,释放紫红色染料,由分光光度仪比色分析,定量检测组织样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种人体或动物组织(皮肤、肌肉等)、软骨、结缔组织、肿瘤组织等糖胺多糖水平检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,检测准确。
技术背景
糖胺多糖(glycosaminoglycan;GAG),又称为粘多糖(mucopolysaccharide),是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖,由重复的二糖单位,包括六碳糖(hexose)或己糖醛酸(hexuronic acid),链接到己糖胺(hexoamine)上而成。糖胺多糖与核心蛋白(core protein)共价相联,构成蛋白多糖(proteoglycan;PG),成为细胞膜和细胞外基质(extracellular matrix;ECM)的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化(sulfated group),其部位在O或N位上,有利于发挥各种不同的作用,包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化,以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点,使用异染性(metachromatic)阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝(1,9-dimethylmethylene blue;DMMB),在酸性条件下,特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物(Dye-GAG complex),在丙醇解离溶液中,释放出染料,通过分光光度仪(656nm波长)测定,来定量分析糖胺多糖的总含量。
用户自备
1.5毫升离心管: 用于样品操作的容器
微型台式离心机: 用于样品操作
比色皿或酶标板: 用于比色分析的容器
15毫升锥形离心管: 用于样品操作的容器实验步骤
分光光度仪或酶标仪: 用于比色分析
恒温水槽或干式恒温仪: 用于样品反应
样品预处理
1.手术取出动物组织,并秤重以确定200毫克组织重量
2.(选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
3.(选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗1次
4.移入到一个液氮冻存管
5.即刻放进液氮罐过夜
6.次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
7.放进一个1.5毫升离心管
8.加入xx微升萃取液(Reagent B)
9.强力涡旋震荡1分钟,充分混匀
10.放进56℃恒温水槽孵育16小时
11.放进90℃恒温水槽孵育10分钟
12.放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
13.小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
14.置于冰槽里备用
1.移取xx微升上述配制的标准液(Reagent E)到1.5毫升离心管
2.加入xx毫升染色液(Reagent C)
3.涡旋震荡15秒
4.室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5.即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6.小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7.加入xx毫升解离液(Reagent D)
8.涡旋震荡15秒
9.室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10.转移到新的比色皿
11.即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得标准样品吸光读数
12.重复实验步骤1至11四次
13.构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数;横座标(X轴)为标准糖胺多糖含量(微克)
样品测定
1.加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管
2.加入xx毫升染色液(Reagent C)
3.涡旋震荡15秒
4.室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5.即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6.小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7.加入xx毫升解离液(Reagent D)
8.涡旋震荡15秒
9.室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10.转移到新的比色皿
11.即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得样品吸光读数
12.根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量(微克)
浓度计算
根据上述标准曲线样品对应糖胺多糖含量(微克)÷0.050(样品容量;毫升)=微克糖胺多糖/毫升
注意事项
1.本产品为25次操作,包括标准样品
2.本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸(hyaluronate)的检测
3.本产品可以检测硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸角质素(keratan sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸类肝素(heparan sulfate)等主要糖胺多糖
4.本产品检测范围为0.2至5微克糖胺多糖
5.操作时,须戴手套
6.系统操作时,标准样品测定只需1次
7.空白对照读数通常小于0.06,如果超过表明抽去上清操作不当
8.孵育时,避免光照
9.如果样品糖胺多糖含量过低,可以浓缩样品或增加样品量至100微升
10.样品浓度可以表述为:微克糖胺多糖/组织重量;微克糖胺多糖/组织总蛋白等
11.本公司提供系列糖类代谢检测试剂产品
质量标准
1.本产品经鉴定性能稳定