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PCR试剂盒
探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

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甘蔗杆状病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
英文名：Sugarcane bacilliform virus Probe qPCR Kit

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产品信息

甘蔗黄叶毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
本试剂盒可用于检测甘蔗杆状病毒。甘蔗杆状病毒（Sugarcane bacilliform virus, SCBV）是一种对全球甘蔗种植构成严重威胁的病毒。它属于花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）杆状 DNA 病毒属（Badnavirus）。该病毒已广泛存在于世界各甘蔗产区。本产品是根据探针法荧光定量 PCR 原理开发的甘蔗杆状病毒检测试剂盒。

产品及特点

1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据甘蔗杆状病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
规格及成分：

成分	规格
2 × OneStep Probe Mix	500 μL
DEPC-H2O	1 mL
荧光模板稀释液	1 μL
甘蔗黄叶病毒 RT-qPCR 引物-探针混合液	210 μL
甘蔗黄叶病毒 RT-qPCR 阳性对照(1.00E+08 拷贝/μL)	50 μL
使用手册	1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
使用方法：
一、RNA 提取(样本制备区)

1. （选做）如果有 N 个样品待提取，最好设置 N+2 个提取，多出的是 PC（样品制备阳性对照）和 NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10μL 再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

2. 用自选方法提取纯化样品 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光模板稀释液，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1.00E+08 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1.00E+07 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1.00E+07 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1.00E+06 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1.00E+06 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1.00E+05 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1.00E+05 拷贝/μL 即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
准备足量的 PCR 管(样品管、阴性对照管、阳性对照管)，向各 qPCR 管中分别加入
下列成分。

成份

N个待检样品管

qPCR阴性对照管

qPCR
阳性对照

2 × OneStep Probe Mix

各 10 μL

10 μL

甘蔗杆状病毒 RT-qPCR 引物-探针混
合液

各 5μL

5 μL

转移至模板添加区。
四、添加模板(模板添加区)
向 qPCR 管中分别加入 5 μL 模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模
板、甘蔗黄叶病毒 RT-qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
五、扩增反应(扩增及产物分析区)
将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：

过程	温度	时间
预变性	95℃	3 min
qRT-PCR反应45个循环	95℃	15 sec
qRT-PCR反应45个循环	60℃	20 sec

六、结果分析

1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，推算出其浓度。

2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：阳性对照（1.00E+05 拷贝/μL）结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲线。

阴性对照结果：Ct 值>40 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。

样本检测结果：Ct 值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出甘蔗黄叶病毒，结果为阳性；Ct 值>40 或无 Ct 值，表明样本中未检测出甘蔗黄叶病毒，结果为阴性；Ct值在 38-40 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 38-40 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。