GUS(β-Galactosidase)基因是存在于E.coli等一些细菌基因组内的编码β-葡萄糖苷酸酶的一种水解酶,该基因常作为融合标记用于植物转基因分析和调控研究中。GUS受体基因系统有表达E.coli GUS酶的稳定性和在植物内的低活性,绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物,其反应产物可用多种方法检测出来。5-Bromo-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide,cyclohexylammonium salt(简称为X-Gluc或X-GlcA)分子量为521.8,CAS号为18656-96-7,是检测大肠杆菌中GUS基因的底物,可快速检测植物中GUS基因融合标记。
β-葡萄糖苷酶基因染色试剂盒(β-Galactosidase Reporter Gene Staining Kit)简称为GUS染色液,其染色原理是适宜的反应条件下,β-葡萄糖苷酶(GUS)可将X-Gluc水解成蓝色物质,该物质不溶解于转基因的细胞核组织中的靛蓝物质,具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点,可用肉眼或显微镜观察到。GUS染色液可用于生物化学活性分析、免疫分析以及组织和细胞的组织化学染色,多用于转基因植物的GUS基因表达分析。该试剂仅用于科研领域,不适用于临床诊断或其他用途。
自备材料:
无水乙醇、甲醇
去离子水
小瓶或多孔板、显微镜
操作步骤(仅供参考):
配制X- GlcA Solution:取X-GlcA solvent 229μl加入至80mg X-GlcA中或取适量上述2种物质溶解,使其浓度达到350mg/ml,轻轻Vortex混匀,即为X- GlcA Solution,分装后,-20℃避光保存。
固定(固定不是必须的步骤,如果不需要固定,直接进行操作步骤4):
取转基因植物组织,入3~5ml清洁小瓶或多孔板中。
取适量2×Fixation Buffer与去离子水等量稀释即获得1×Fixation Buffer。加入1×Fixation Buffer,使Fixation Buffer完全浸没组织。室温孵育45min,弃液。
配制洗涤液: 按GUS Buffer A:去离子水=1:20稀释,即为洗涤液。用配制好的洗涤液漂洗3次,每次1min。
4、加入适量GUS染色液,使GUS染色液完全浸没组织。
5、用真空泵抽取小瓶或多孔板中的气体,抽取时间应大于2min。该步骤是为了抽取植物组织内的气体,并使染色液更容易进入组织内。
6、立即盖紧瓶子或多孔板,37℃孵育24h。随着孵育时间的延长,蓝色渐渐出现,当表达量较高时,GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。
7、用乙醇脱去样本的叶绿素,一般样本浸没于乙醇1~3h。如有必要可重复该脱色步骤,以便彻底清除叶绿素。样本保存于乙醇中,可用肉眼或普通光学显微镜下观察。
注意事项:
配制好的GUS染色液可以4℃避光保存半个月。
X-GlcA Solution应避免反复冻融,否则染色效率会下降。
由于组织特异性等原因,蓝色颜色反应可能不完全一致,应注意摸索具体实验条件。
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